생활 화학 9탄 - 콜라게나아제

경단백질의 일종인 콜라겐을 분해하는 효소의 하나로써 콜라게나제는 콜라겐을 주성분으로하는 수반되는 결합 조직으로부터 다양한 특수 세포 유형을 분리하는데 널리 사용되어왔다. 기초 연구에서 세포 기능에 대한 연구는 1 차 세포 ​​분리에 필수적이며, 고형 기관에서의 암 줄기 세포 분리는 임상 연구에 중요합니다 3,4 암 병리 생리학. 또한, 1 차 세포 ​​분리 기술은 이식 형 요법 5,6 및 재생 의학 7,8의 분야에서 치료 절차의 필수 불가결 한 측면이다. 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 콜라게나 제 제품은 Clostridium histolyticum에서 파생됩니다. 우리 모두 알다시피, 고도로 정제 된 콜라게나 아제의 경우에도 클로스 트리 디움 콜라겐 제품은 배치 간 변화를 보여 다양한 분리 결과를 나타내므로 개선이 있습니다. 

클로스트리디움 콜라게나 제 제품에는 두 가지 성분이 있습니다. 효소 혼합물의 조성은 특정 작동 절차 및 장비 특성을 최적화하도록 변형 될 수 있습니다. 그러나, 이들 두 성분을 하나의 효소 생성물에 조합하면 이의 균질성이 손상 될 수 있고 가공 동안자가 분해를 일으킬 수 있으며, 이는 콜라겐 생성물 클로스 트리 디움에서 변동성을 초래할 수있다.

이전에 Vibrio로 분류 된 그람 음성 박테리아이며 여러 유형의 Vibrio가 콜라게나를 생산하는 것으로 알려져 있습니다. 콜레라 박테 리움의 균주로부터의 콜라게나 제는 정제되어 콜라겐의 높은 분해 활성을 갖는 단일 단백질로서 기술되었다. 콜라게나 제는 안정적이고 생리 학적 pH 및 온도에서 활성이다. 또한, 원래의 피부 조직에서의 콜라겐과 비교하여,이 효소는 많은 유형의 콜라겐을 함유하는 무두질 된 피부를 분해 할 수 있으며, 이는 서로 밀도가 높고 더 밀접하게 결합되어있다. 이러한 특성은 대략 60 kDa의 Grimontia hollisae 균주가 단일 성분 콜라게나 제 생성물로서 1 차 세포를 분리 할 수 ​​있음을 나타냅니다.

콜레라에 1706B 균주로부터의 재조합 콜라게나 제는 Brevibacterium 빠른 발현 시스템 을 사용하여 성공적으로 생산되었다. Vibrio cholerae collagenase에 의해 암호화 된 유전자를 클로닝 할 때, 우리는 박테리아 ~ 60 kDa에 의해 분비 된 collagenase가 처음에 74KD 단백질로 번역되었음을 발견했다. 74 kDa 산화 단백질을 발현 한 후, 대부분의 콜라게나 제 단백질은 약 60 kDa로 자동 절단되며, 가장 중요하게는 74 kDa 및 약 60 kDa 단백질은 독특한 콜라게나 제 활성을 나타냅니다. 산화 된 단백질 74kDa는 콜라게나 제의 생성에 적합하지 않기 때문에, 생성물은 두 성분의 존재로 인해 균질성이 결여되어 있기 때문이다. 또한 제어되지 않은 자발적 차단 메커니즘으로 인해 제품의 안정성이 떨어집니다. 따라서, 재조합 단백질 74 kD는 통상적 인 특성을 나타내지 않으며, 즉 재조합 단백질은 균질성 및 안정성에서 원래 단백질을 초과한다. Vibrio cholerae로부터 콜라게나 제 재조합 체를 생산하여 1 차 세포를 분리하기위한 효소 생성물을 확립하기 위해서는, ~ 60kDa의 재조합 단백질의 직접 발현이 필요하다. 그러나, 최근 재조합 단백질 발현 기술의 개발에도 불구하고, 재조합 적으로 생산 된 단백질의 활성 및 양을 신뢰성있게 예측하는 것은 어렵 기 때문에 이 목표를 달성하려는 노력은 유망하지 않을 것이다.

기사의 목적은 두 가지입니다. Vibrio cholerae로부터 약 60 kDa의 재조합 콜라게나 제를 설계하고 Brevibacterium 발현 시스템을 사용하여 직접 발현 될 수 있는지 테스트 하였다. 둘째, 우리는 ~ 60 kDa 재조합 단백질이 콜라겐 분해 활성과 콜라게나 제 생성물을 생산하기에 충분한 안정성을 가지고 있는지, 그리고 그것이 일차 세포를 분리하는데 사용될 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 일차 세포의 분리에서 재조합 단백질의 효능을 평가하기 위해, 섬 형태 및 기능을 검사하기위한 시스템이 완성 되었기 때문에 마우스 섬 분리 방법을 사용 하였다. 또한, 당근을 분리하는 데 사용되는 콜라게나 제 제품은 일차 세포를 분리하는 데 사용되는 다른 절차와 비교하여 임상 설정에서 더 광범위하게 개발되었습니다.

쥐 췌장으로부터 기능성 섬의 분리에 대한 비브리오 콜레라에 콜라게나 제 62-kDa 재조합 체의 적합성 평가결과
마우스 췌장으로부터 기능성 섬의 단리에 대한 G. hollisae의 콜라게나 제 62-kDa 재조합 체의 적합성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 18 개의 마우스 췌장을 단리 표적으로서 사용 하였다. 우리는 각각 0.0125, 0.025, 0.05, 0.10, 0.15 및 0.20 mg / mL의 췌장 덕트에 3 가지 농도의 췌장 재조합 콜라게나 제 G. hollisae를 주입하고 고정 농도 0.012 mg / mL 중화 프로테아제와 혼합 하였다. 각각의 콜라게나 제 농도에 대해. 모든 췌장을 37 ° C에서 15 분 동안 배양하여 분리 한 다음 간헐적 밀도 구배를 사용하여 분리 된 조직을 정제했습니다. 정제 된 당근을 이황화 영역으로 염색하고 섬의 수 및 그의 등가물을 평가하는데 사용 하였다. 콜라게나 제의 농도가 증가함에 따라, 섬 및 섬 등가의 수가 증가하여, 콜라게나 제 농도 0.05 mg / ml에서 약 500 섬 및 170 등가 섬의 상관 플랫폼에 도달한다. 또한, 우리는 Clostridium histolyticum에서 정제 된 콜라게나 제 생성물의 섬과 같은 분리 경향이 Vibrio cholerae의 재조합 콜라게나 아제 62kD와 비교할 수 있음을 발견했다 (그림 5a, b). 다음으로 Vibrio cholerae에서 분리 한 62kDa collagenase를 사용하여 분리 한 섬의 기능을 확인하기 위해 5 마리의 마우스 이식에 대한 생물학적 분석을 수행했습니다.이 테스트는 섬 기능을 평가하기위한 황금 표준으로 간주됩니다.

 

62kDa 콜라게나 제 (Staphylococcus coryneformis 및 thermolysin으로 구성)를 사용하여 각각 0.15 mg / ml 및 0.012 mg / ml 농도의 이소성 섬을 분리했습니다. 300 마리의 정제 된 섬을 각각의 마우스 수용자에 대해 신장 캡슐 아래에 이식 하였다. 스트렙토 조토 신의 사전 투여에 의해 당뇨병을 모든 마우스에 도입 하였다. 작은 섬을받는 모든 마우스에서, 혈당 농도는 점차적으로 감소하고 이식 후 3 일 이내에 정상으로 돌아 왔습니다. 대조적으로, 당근을받지 않은 당뇨병 마우스는 여전히 혈액에서 고농도의 포도당을 나타냈다. 이식 후 38 일째에, 혈당 수준에 도달 한 모든 마우스는 섬과 같은 플라크로 신장을 제거한 직후에 고혈당증을 회복시켰다. 이식 34 일 후 섬 수선을받은 5 마리 마우스 중, 4 마리 마우스는 복강 내 포도당 내성 시험에 의해 거의 정상적인 반응을 나타냈다. 인슐린으로 화학적 면역 염색을 사용한 조직 학적 분석은 인슐린-양성 섬 침착 물의 존재를 보여 주며 섬과 같은 구조는 신장 캡슐 아래 잘 보존되었습니다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae)로부터의 62 kDa 콜라게나 제 재조합 체가 C. histolyticum28의 정제 된 생성물과 유사한 기능성 쥐 섬을 분리 할 수있는 능력을 가지고 있다고 결론 내렸다.

SDS 페이지
Laemmli44 방법에 따르면, SDS-PAGE는 7.5 % 또는 10 % 폴리 아크릴 아미드 겔로 수행되었다. 콜라겐 가수 분해 활동 확인 앞에서 언급했듯이 FITC라고하는 콜라겐 타입 I은 위에서 설명한 45와 같이 콜라겐 분해 활동을 측정하는 데 사용됩니다. 콜라겐 분해 활성의 한 단위는 30 ° C에서 분당 1mg을 분해하는 FITC라고하는 콜라겐의 양으로 정의됩니다. 단백질 농도는 쿠마시 플러스-브래드 포드 브래드 포드 테이 분석 시약을 사용하여 측정 하였다. 콜라게나 제 안정성 분석
콜라게나 제 (0.5mg / mL)를 0.2M NaCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 비스-트리스 -HCl (pH 7.5)에서 37 ° C에서 배양 하였다. 상이한 시간에 인큐베이션 한 후, 상기 기재된 바와 같이, 반응 혼합물을 SDS-PAGE로 분석하고, 그의 콜라겐 활성을 FITC 유형 콜라겐을 사용하여 측정 하였다.

실시간 젤라틴 zymography 46에서 이전에 기술 된 바와 같이, 젤라틴 지모 그램 분석은 실시간으로 수행되었다. 비 환원 조건 하에서, 콜라게나 제는 0.05 % 젤라틴을 함유하는 10 % 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 노출되었고 FITC로 표지되었다. 채도 크기 제외 수퍼 덱스 200 HR10 / 30 (GE Healthcare) 칼럼을 사용하여 Alliance 2895 시스템 (Waters, Milford, MA, USA)에서 콜라게나 제 배제 부피 크로마토 그래피를 수행 하였다. 샘플을 컬럼 상에 로딩하고 0.75 mL / 분의 유속으로 0.2 mSodium을 함유하는 50 mM 디트리스 HCl (pH 7.5)에서 허혈성 용리를 수행한다. 개별 단백질 단편은 220 nm에서 검출되었다.